MultiMix - Agilent

MultiMix™
Dual-Colour Reagent
Anti-Human HLA-DP, DQ, DR Antigen/FITC
Anti-Human CD3/RPE
Nr kat. FR867
Przeznaczenie
Do diagnostyki In vitro.
FR867 jest przeznaczone do użycia w cytometrii przepływowej. CD3 jest antygenem zastrzeżonym dla szeregu
komórek pan-T, I stanowi wartościowy marker normalnych i nowotworowych komórek T. Anti-HLA-DP, DQ, DR
antigen jest uznane za podstawowe do wstępnej oceny ostrych białaczek, przewlekłych białaczek białaczek
białaczek szpikowych, razem panelem innych przeciwciał (1, 2). FR867 nie jest przeznaczone do typowania
tkanek. Interpretacji wyników może dokonywać wykwalifikowany patolog w oparciu o wywiad kliniczny i inne
testy diagnostyczne.
Odczynnik dostarczony
FR867 składa się z dwóch, starannie dobranych, przeciwciał znakowanych fluorochromami:
Monoclonal Mouse Anti-Human HLA-DP, DQ, DR Antigen, Clone CR3/43, znakowane fluorescein
isothiocyanate isomer 1 (FITC).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD3, Clone UCHT1, znakowane R-phycoerythrin (RPE).
Obydwa koniugaty w FR867 zostały wyprodukowane z oczyszczonych monoklonalnych przeciwciał mysich, o
izotypie IgG1, kappa. FR867 jest dostarczany w postaci płynnej w buforze zawierającym 1% albuminy z
surowicy wołu (BSA) i 15 mmol/L NaN3, o pH 7,2. Każda fiolka zawiera ilość przeciwciała na 50 oznaczeń (10
L przeciwciała na maksymalnie 106 leukocytów z normalnej ludzkiej krwi obwodowej).
Swoistość
Przeciwciało,
nr katalogowy
Fluorochrom
Nr kat. odczynnika
kontrolnego
FR867
FITC and RPE
X0932
Anti-Human HLA-DP, DQ, DR Antigen, CR3/43 reaguje z łańcuchem  heterodimeru  na wszystkich
produktach rodziny genów DP, DQ i DR. Przeciwciało zostało zakwalifikowane podczas pierwszego
International Workshop and Conference on Monoclonal Antibodies to Human MHC Class II Antigens (1983), a
jego swoistość I pełna charakterystyka zostały potwierdzone wieloma technikami, w tym reakcją z
wyizolowanym antygenem, immunoblottingiem i znakowaniem komórek transfekowanych (3).
W normalnej krwi obwodowej przeciwciało barwi komórki B I większość monocytów, ale nie reaguje z normalnymi
komórkami T i granulocytami o podzielonym jądrze. Może jednak znakować aktywowane limfocyty T we krwi
obwodowej (4). Anti-HLA-DP, DQ, DR Antigen nie reaguje z erytrocytami ani megakariocytami (5).
Analiza immunohistochemiczna wykazała, że Anti-HLA-DP, DQ, DR, Antigen, CR3/43 znakuje AML (5/5
przypadków (5)), wywodzącą się z komórek B ALL (3/3 przypadki (5)), przewlekłe białaczki i chłoniaki z
komórek B i T (3/3 przypadki (5) i 45/46 przypadków (6)), a także CML podczas kryzysu blastycznego (1/1
przypadek (5)). Przeciwciało nie znakuje komórek szpiczaka (0/3 przypadki), ale wykazuje słabe barwienie
mniejszości komórek przerzutowych raków sutka (2/5 przypadków) (5).
Anti-CD3, UCHT1, zostało zakwalifikowane podczas pierwszego I trzeciego International Workshops and
Conferences on Human Leucocyte Differentiation Antigens, a badania w wielu laboratoriach potwierdziły jego
reaktywność z CD3 (7). Anti-CD3, UCHT1, reaguje z łańcuchem CD3, o masie cząsteczkowej 20 kDa (8).
Środki ostrożności
1. Do stosowania przez osoby przygotowane zawodowo.
2. Produkt zawiera azydek sodowy (NaN3), odczynnik chemiczny silnie toksyczny w czystej postaci. W stężeniu
obecnym w produkcie, chociaż nie klasyfikowanym jako niebezpieczne, azydek sodowy może reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, tworząc silnie wybuchowe pochodne lub azydki tych metali.
Przy usuwaniu odpadów przepłukać spływ dużą ilością wody, aby uniknąć tworzenia się azydków.
3. Jak w przypadku każdego materiału biologicznego należy stosować odpowiednie procedury.
Przechowywanie
Przechowywać w temp. 2-8oC. Nie używać po upływie daty ważności wskazanej na opakowaniu. Jeśli produkt
był przechowywany w warunkach innych niż wskazane, użytkownik musi sprawdzić jakość produktu. Ponieważ
nie ma wyraźnych oznak wskazujących na zmianę trwałości produktu, zawsze należy badać dodatnią i ujemną
kontrolę równolegle z próbką badaną. Jeżeli pojawia się nieswoiste barwienie bez zmiany procedur
laboratoryjnych i można podejrzewać, że dzieje się to z winy przeciwciała, należy skontaktować się z serwisem
technicznym firmy Dako.
Wykonanie odczynu
1.
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej o
wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Dodać 10 µL FR867 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
3.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8 °C lub przez 15–30 minut w
temperaturze pokojowej (20–25°C).
4.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym
pomieszczeniu.
(108482-004)
FR867/PL/OKJ/02.05.05 str. 1/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
5.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, w ciemnym
pomieszczeniu.
6.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
7.
Dodać do probówki 2 mL PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę komórek za pomocą mieszadła
wibracyjnego.
8.
Powtórzyć etap 6.
9.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
10.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności i
temperaturze 2–8°C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie wykonywania
odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury
Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne w celu
weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 2: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą się
zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w
każdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do izotypów i fluorochromów sprzężonego przeciwciała. Zalecanym dwubarwnym odczynnikiem
kontrolnym dla FR867 jest odczynnik Dako o numerze kat. X0932.
Etapy 4 i 5: Jeśli używany jest inny odczynnik do lizy komórek, należy przy jego doborze kierować się poniższymi
zaleceniami. Należy zauważyć, że jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza (np. Dako
EasyLyse™, nr kat. S2364) PBS w kroku 9 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, chyba że próbka zostanie
przeanalizowana w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy.
Etap 10: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej ilości komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca ekspresji
antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru.
Literatura
1.
Van Dongen JJM, Adriaansen HJ. Chapter 6. Immunobiology of leukaemia. In: Henderson ES, Lister TA,
Greaves MF. Leukemia. Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo: WB Saunders
Company; 1996. p. 83-130.
2.
De Zen L, Orfao A, Cazzaniga G, Masiero L, Cocito MG, Spinelli M, et al. Quantitative multiparametric
immunophenotyping in acute lymphoblastic leukemia: correlation with specific genotype. I. ETV6/AML1
ALLs identification. Leukemia 2000;14:1225-31.
3.
Appendix. Table of workshop monoclonal antibodies and a synopsis of their principal characteristics. In:
Steel CM, editor. Disease markers. Special Issue. Human MHC Class II Antigens: Genetics, Structure
and Function. Sussex: John Wiley & Sons, Ltd., 1984;2:363-9.
4.
Erber WN, Pinching AJ, Mason DY. Immunocytochemical detection of T and B cell populations in routine
blood smears. Lancet 1984;I:1042-5.
5.
Falini B, Martelli F, Tarallo F, Moir DJ, Cordell JL, Gatter KC, et al. Immunohistological analysis of human
bone marrow trephine biopsies using monoclonal antibodies. Br J Haematol 1984;56:365-86.
6.
Smith MEF, Holgate CS, Williamson JMS, Grigor I, Quirke P, Bird CC. Major histocompatibility complex
class II antigen expression in B and T cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Pathol 1987;40:34-41.
7.
McMichael AJ, Gotch FM. T-cell antigens: new and previously defined clusters. In: McMichael AJ,
Beverley PCL, Cobbold S, Crumpton MJ, Gilks W, Gotch FM, et al., editors. Leucocyte typing III. White
cell differentiation antigens. Proceedings of the 3rd International Workshop and Conference; 1986 Sept
21-26; Oxford, England. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1987. p.31-62.
8.
Tunnacliffe A, Olsson C, Traunecker A, Krissansen GW, Karjalainen K, de la Hera A. T3.2. The majority
of CD3 epitopes are conferred by the epsilon chain. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP,
Schmidt RE, Stein H, et al., editors. Leucocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings
of the 4th International Workshop and Conference; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York,
Tokyo: Oxford University Press; 1989. p. 295-6.
Objaśnienia symboli
(108482-004)
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
Zużyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Chronić przed światłem
(sprawdź w rozdz.
przechowywanie)
Producent
Sprawdź w instrukcji
stosowania
Numer serii
FR867/PL/OKJ/02.05.05 str. 2/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17