Monoclonal Mouse

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
Melanosome
klon HMB45
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR052
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Melanosome, klon HMB45, Ready-to-Use, (Link), jest
przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciała są przydatne w
identyfikacji melanocytów wykazujących tworzenie niedojrzałych melanosomów w skórze prawidłowej,
komórkach znamion i tkankach czerniaka. Dodatnie wyniki testu stosuje się w klasyfikacji czerniaków i zmian
barwnikowych oraz w różnicowaniu przerzutów czerniaków bezbarwnikowych od innych niskozróżnicowanych
nowotworów o nieznanym pochodzeniu. Wyniki panelu przeciwciał są pomocne w diagnostyce różnicowej.
Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez ocenę morfologiczną,
wykonanie odpowiednich prób kontrolnych i interpretowana przez doświadczonego patologa w kontekście historii
choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Streszczenie
i informacje ogólne
Wykazano, że przeciwciała przeciwko melanosomom (HMB45) reagują z segmentem sialowanego
glikokoniugatu podatnego na działanie neuraminidazy, o masie 10 kDa, występującego w premelanosomach i
młodych (niedojrzałych) melanosomach (2–4).
Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub
następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały
niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu,
6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Dostarczany
odczynnik
Gotowe do użycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym
białko stabilizujące i roztwór NaN3 o stężeniu 0,015 mol/L.
Klon: HMB45
Izotyp: IgG1, kappa
Immunogen
Wyciąg przerzutów czerniaka pigmentowanego do węzłów chłonnych
Swoistość
Obecność antygenu oznacza występowanie aktywnego tworzenia melanosomów, co pozwala na różnicowanie
komórek barwnikowych (5). Antygen występuje również w prawidłowych płodowych melanocytach (2, 3),
natomiast nie stwierdza się go w prawidłowych ludzkich melanocytach w fazie spoczynku, niezależnie od stopnia
pigmentacji (1, 3, 6). Po aktywacji dojrzałe melanocyty mogą ponownie wykazywać ekspresję HMB45,
stwierdzanego w melanocytach płodowych. Tego typu melanocyty mogą być aktywowane przez różnorodne
bodźce. Na przykład komórki wykazujące obecność antygenu HMB45 wykryto w tkance pokrywającej ziarninę i
tkankach sąsiednich, naczyniakach krwionośnych, guzach podścieliska o bogatym unaczynieniu oraz rakach
podstawnokomórkowych (5–8). Niekiedy mieszki włosowe wykazują dodatni odczyn wywołany obecnością
melanocytów w fazie pobudzenia (1). Dodatni odczyn z HMB45 nie występował w przypadku melanocytów
znajdujących się w obrębie plam soczewicowatych lub leżących w obrębie naskórka ponad rozrostami
fibroblastycznymi, np. bliznowcach, włókniakach skóry oraz starych włókniejących naczyniakach krwionośnych (8).
Prawidłowe tkanki niezawierające melanocytów nie reagują z przeciwciałami HMB45.
Środki ostrożności
1.
2.
3.
4.
5.
(115362-001)
Odczynniki przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników.
Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Stężenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z
ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika używać dużych ilości wody do przepłukiwania, aby
uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
Podobnie jak w przypadku każdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, należy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
Należy stosować właściwe wyposażenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą
bądź oczami.
Niewykorzystany odczynnik należy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi.
307119PL_001 s. 1/3
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na opakowaniu.
Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane na ulotce dołączanej do opakowania,
Użytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego
produktu. Z tego względu jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjentów, należy wykonywać
dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie można wyjaśnić
różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, należy się skontaktować
z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe należy pociąć na skrawki o wymiarach 4 µm.
Wymagane jest poddanie preparatów cieplnemu odmaskowaniu antygenu. Optymalne wyniki uzyskuje się w
wyniku wstępnej obróbki tkanek przy użyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (10x)
(nr kat. K8000/K8004).
Odparafinowane skrawki: Zaleca się wstępną obróbkę utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie
skrawków tkankowych przy użyciu Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera
Instrukcja użytkownika aparatu PT Link.
Postępować według procedury wstępnej obróbki tkanek zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX
Target Retrieval Solution, High pH (10x) (Link) (nr kat. K8000/K8004). Dla aparatów PT Link należy stosować
następujące parametry: Temperatura wstępnego ogrzewania: 65°C; temperatura i czas odmaskowania antygenu:
97°C przez 20 (±1) minut; ochłodzić do 65°C. Przepłukać skrawki rozcieńczonym roztworem o temperaturze
pokojowej EnVision FLEX Wash Buffer (10x) (Link) (nr kat. K8000).
Skrawki zatapiane w parafinie: W celu odmiennego przygotowania próbek zarówno odparafinowanie, jak i
odmaskowanie można wykonać w aparacie PT Link z zastosowaniem zmienionej procedury. Informacje można
znaleźć w Instrukcji użytkownika aparatu PT Link. Po zakończeniu wykonywania odczynu skrawki tkankowe
należy poddać odwodnieniu, oczyszczeniu i nakryć za pomocą środka do trwałego zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek Dako Silanized Slides (nr kat. S3003).
Wykonanie odczynu
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym system wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8000). W oprogramowaniu
Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Szczegółowe informacje dotyczące
wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w Instrukcji użytkownika aparatu Autostainer
Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w używanym systemie Autostainer, należy skontaktować się z działem
wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury inkubacji należy również przeprowadzać w
temperaturze pokojowej.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zależności od rodzaju materiału oraz sposobu jego przygotowania i
powinny być określone indywidualnie w każdym laboratorium. Aby możliwe było wykonanie oceny przez
patologów z różnym nasileniem odczynu preparatów, należy skontaktować się z działem obsługi/obsługą
techniczną firmy Dako w celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. Należy upewnić
się, że działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe — w tym celu należy ocenić, czy odczyn jest taki
jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną za pomocą EnVision( FLEX Hematoxylin (Link) (nr kat.
K8008). Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów należy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z użyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować komórki
czerniaka, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji
taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX
Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja odczynu
Przeciwciała dają odczyn cytoplazmatyczny.
Charakterystyka
wydajnościowa
Tkanki prawidłowe: Do pochodzących od pacjentów dorosłych prawidłowych tkanek, które wykazują dodatni
odczyn z przeciwciałami przeciwko melanosomom HMB45, zalicza się melanocyty (komórki płodowe i
subpopulacje melanocytów zawierające niedojrzałe melanosomy), nabłonek barwnikowy siatkówki pochodzenia
płodowego lub dziecięcego. Do struktur dających ujemny odczyn należą: nadnercza, mózg, sutek, pęcherzyk
żółciowy, tkanki przewodu pokarmowego, nerki, wątroby, płuc, tkanka limfoidalna, komórki mezenchymalne,
trzustka, nerwy obwodowe, nabłonek barwnikowy siatkówki (komórki dojrzałe), gruczoły ślinowe, skóra
(prawidłowe melanocyty w fazie spoczynku, melanofagi, komórki Langerhansa, keratynocyty, mieszki włosowe,
nerwy skórne, gruczoły potowe i łojowe) oraz jądra.
Tkanki nieprawidłowe: Przeciwciała przeciwko melanosomom HMB45 wykazują dodatni odczyn w 245 na 256
(95,7%) przypadków czerniaków z wyłączeniem postaci desmoplastycznej (1, 3, 5, 6, 9–14) oraz w 245 na 291
(84,2%) przypadków czerniaków z uwzględnieniem postaci desmoplastycznej (1, 3, 5, 6, 9, 13–14). Dodatni
wynik odczynu z przeciwciałami przeciw antygenom czerniaka stwierdza się również w przypadku atypowej
hiperplazji barwnikowej (1), melanocytarnej neuroendodermy u noworodków (1/1) (6), guzie nerek o typie
angiomyolipoma nerek (27/29) (11, 12) oraz różnych odmian znamion barwnikowych (218/228) (1, 5, 6, 10).
(115362-001)
307119PL_001 s. 2/3
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to intermediate filament proteins of human cells: Unique and
cross-reacting antibodies. J Cell Biol 1982; 95:414
Kapur RP, Bigler SA, Skelly M, Gown AM. Anti-melanoma monoclonal antibody HMB45 identifies an
oncofetal glycoconjugate associated with immature melanosomes. J Histochem Cytochem 1992; 40(2):207
Esclamado RM, Gown AM, Vogel AM. Unique proteins defined by monoclonal antibodies specific for human
melanoma. Amer J Surg 1986; 152:376
Taatjes DJ, Arendash-Durand B, von Turkovich M, Trainer TD. HMB-45 antibody demonstrates
melanosome specificity by immunoelectron microscopy. Arch Pathol Lab Med 1993; 117:264
Skelton HG, Smith KJ, Barrett TL, Lupton GP, Graham JH. HMB-45 staining in benign and malignant
melanocytic lesions. Amer J Dermatopathol 1991; 13:543
Colombari R, Bonetti F, Zamboni G, Scarpa A, Marino F, Tomezzoli A, Capelli P, Menestrina F, Chilosi M,
Fiore-Donati L. Distribution of melanoma specific antibody (HMB-45) in benign and malignant melanocytic
tumors. Virch Arch A Pathol Anat 1988; 413:17
Smoller BR, Hsu A, Krueger J. HMB-45 monoclonal antibody recognizes an inducible and reversible
melanocyte cytoplasmic protein. J Cutan Pathol 1991; 18:315
Smoller BR, McNutt NS, Hsu A. HMB-45 recognizes stimulated melanocytes. J Cutan Pathol 1989;16:49
Wick MR, Swanson PE, Rocamora A. Recognition of malignant melanoma by monoclonal antibody HMB-45.
An immunohistochemical study of 200 paraffin-embedded cutaneous tumors. J Cutan Pathol 1988; 15:201
Ashfaq R, Weinberg AG, Albores-Saavedra J. Renal angiomyolipomas and HMB-45 reactivity. Canc 1993;
71:3091
Pea M, Bonetti F, Zamboni G, Martignoni G, Riva M, Colombari R, Mombello A, Bonzanini M, Scarpa A,
Ghimenton C, Donati LF. Melanocyte-marker-HMB-45 is regularly expressed in angiomyolipoma of the
kidney. Pathol 1991; 23:185
Bonetti F, Chiodera PL, Pea M, Martignoni G, Bosi F, Zamboni G, Mariuzzi GM. Transbronchial biopsy in
lymphangiomyomatosis of the lung. HMB45 for diagnosis. Amer J Surg Pathol 1993; 17(11):1092
Ordonez NG, Xiaolong JI, Hickey RC. Comparison of HMB-45 monoclonal antibody and S-100 protein in the
immunohistochemical diagnosis of melanoma. Amer J Clin Pathol 1988; 90(4):385
Bacchi CE, Goldfogel GA, Greer BE, Gown AM. Paget’s disease and melanoma of the vulva. Gyn Oncol
1992; 46:216
Wydanie 09/07
(115362-001)
307119PL_001 s. 3/3